3. ROTIFERI
Philippe Dhert
Laboratory of Aquaculture & Artemia Reference Center
University of Gent, Belgium
3.1. Introduzione
Sebbene i rotiferi della specie Brachionus plicatilis fossero considerati una peste per le colture in laghetti di anguille negli anni '50 e '60, dei ricercatori giapponesi hanno capito che potevano essere usati come cibo vivo per i primi stadi larvali dei pesci marini. I successi ottenuti nelle operazioni di allevamento commerciale dell'orata rossa di mare (Pagrus major) hanno incentivato nuove ricerche nello sviluppo delle tecniche di coltura di massa dei rotiferi.
Venticinque anni dopo il primo utilizzo dei rotiferi nella larvi-coltura, numerosissime tecniche di produzione intensiva vengono eseguite abitualmente in tutto il mondo. La disponibilità in grandi quantità di questa risorsa di cibo vivo ha contribuito al successo dell'allevamento di più di 60 specie di pesci marini e di 18 specie di crostacei. A quanto ne sappiamo, solamente in una regione della Cina vengono allevati dei rotiferi selvatici (Brachionus plicatilis) per essere poi utilizzati come cibo vivo per gli allevamenti locali di gamberi e granchi.
Il successo della coltura dei rotiferi è dovuto a molteplici aspetti: la loro natura planctonica, la loro tolleranza ai cambiamenti ambientali ed il loro rateo di riproduzione (una media di 0,7-1,4 nuovi rotiferi per ogni femmina al giorno). Inoltre, la loro piccola taglia e scarsa velocità di nuoto, li rende delle prede ideali per le larve di pesce che hanno già esaurito il contenuto del loro sacco vitellino, ma che hanno delle dimensioni boccali ancora troppo limitate per poter ingerire i naupli di Artemia.
Il grande potenziale delle colture di rotiferi è dato dalla possibilità di allevare questi organismi in colture ad altissime densità (fino a 2000 animali per ml). Anche a tali densità, i rotiferi riescono a riprodursi velocemente e ciò permette di produrre grandi quantità di cibo vivo in pochissimo tempo. Infine, grazie alla loro natura di animali filtratori, è possibile arricchire il loro corpo con i nutrienti necessari alle larve predatrici.
3.2. Morfologia
I Rotatoria (=Rotifera) sono i più piccoli organismi metazoi, di cui più di 1000 specie sono state classificate ed il 90% sono d'acqua dolce. Raramente la lunghezza del corpo raggiunge i 2mm e i maschi sono più piccoli rispetto alle femmine (alcuni misurano solamente 60 μm). Il corpo di tutte le specie è costituito da un costante numero di cellule, ad esempio la specie Brachionus contiene approssimativamente 1000 cellule che non possono essere considerate come singole parti ma come plasma. La crescita degli animali è quindi determinata dall'aumento del plasma e non dalla divisione cellulare.
L'epidermide contiene un denso strato di proteine simili alla cheratina chiamato lorica. La forma della lorica e l'aspetto degli aculei permettono di riconoscere le differenti specie e morfotipi (vedi 3.4.)
Il corpo dei rotiferi è costituito da tre parti distinte: testa, tronco e zampe (Figura 3.1.) La testa possiede l'organo rotatorio o corona che è facilmente riconoscibile dai ciliati anulari (che danno origine al nome di Rotatoria). La corona retrattile permette all'organismo di nuotare e genera un movimento vorticoso dell'acqua che facilita l'assunzione di piccole particelle di cibo (soprattutto alghe e detrito). Il tronco contiene il tratto digestivo, l'apparato escretore e gli organi genitali. Un organo caratteristico dei rotiferi è il mastax (un apparato calcificato nella regione della bocca), che serve a masticare il cibo ingerito. Le zampe sono costituite da una struttura ad anello retrattile prive di segmentazioni e che termina con uno o quattro piedi.
Figura 3.1. Brachionus plicatilis, maschio e femmina.
3.3. Biologia e descrizione della vita
La durata della vita dei rotiferi è mediamente di 3.4 - 4,4 giorni a 25°C. Generalmente, la larva diventa adulta dopo 0,5 - 1,5 giorni e le femmine cominciano a rilasciare le uova approssimativamente ogni quattro ore. Si ritiene che le femmine possano produrre dieci generazioni di nuovi rotiferi prima di morire. L'attività produttiva dei Brachionus dipende dalla temperatura del loro habitat, come illustrato nella Tabella 3.1.
Il ciclo di vita dei Brachionus plicatilis può essere generato da due metodi di riproduzione (Figura 3.2.). Durante la partenogenesi femminile, le femmine amittiche producono uova amittiche (diploidi, con 2 cromosomi) che creano e si sviluppano in femmine amittiche. Sotto specifiche condizioni ambientali, le femmine adottano una più complicata riproduzione sessuale che genera sia femmine mittiche che amittiche. Anche se non sono distinguibili morfologicamente, le femmine mittiche producono uova aploidi (1 cromosoma). Le larve che nascono dalle uova mittiche non fertilizzate diventano maschi aploidi, questi sono un quarto della dimensione delle femmine, non hanno né tratto digerente né ano; tuttavia hanno un grandissimo testicolo riempito di sperma. Le uova mittiche non fertilizzate che nasceranno come individui maschi sono significativamente piccole, mentre quelle mittiche e fertilizzate sono più grandi ed hanno uno spesso strato esterno.
Figura 3.2.
Ci sono poi le cisti che quando vengono esposte a specifiche condizioni ambientali si sviluppano in femmine amittiche. Le cisti si possono formare a causa di cambi di condizioni ambientali dovuti dall'alternanza di temperatura, salinità o cambi di alimentazione. Tuttavia il meccanismo di produzione di queste cisti non è stato completamente compreso e si crede che sia una strategia di sopravvivenza adottata dai rotiferi per contrastare le sfavorevoli condizioni ambientali (freddo e siccità).
3.4. Le differenze tra specie
Solo alcune specie di rotiferi del genere Brachionus sono usate in acquacoltura. Come accennato nell'introduzione, la specie più usata è la Brachionus plicatilis: un abitante cosmopolita delle acque saline d'entroterra e delle acque costiere salmastre.
La dimensione della lorica va dai 100 ai 340 μm, e termina con 6 aculei occipitali.
Tuttavia, per l'uso in acquacoltura, viene utilizzata una semplice classificazione basata su due morfotipi differenti chiamati, Brachionus rotundiformis o piccoli rotiferi (taglia S) e Brachionus plicatilis o grandi rotiferi (taglia L). Le differenze tra queste due specie sono chiaramente distinguibili nelle loro caratteristiche morfologiche: la lunghezza del lorica dei grandi rotiferi va dai 130 ai 340 μm (in media 239 μm) mentre quella dei piccoli va dai 100 ai 210 μm (in media 160 μm). Inoltre, la lorica dei piccoli rotiferi possiede aculei appuntiti mentre le terminazioni degli aculei dei B. plicatilis formano angoli ottusi. (Figura 3.3.)
Figura 3.3. Brachionus rotundiformi (taglia S) e Brachionus plicatilis (taglia L).
In acquacoltura tropicale, i rotiferi ti taglia SS (super small) vengono preferiti per l'alimentazione delle larve di pesce con piccole aperture boccali (siganidi, cernie ed altri peschi il cui cibo di svezzamento dev'essere più piccolo di 100μm). Questi rotiferi, tuttavia, non sono geneticamente diversi dalle specie di taglia S, ma sono comunemente più piccoli.
I morfotipi S e L differiscono anche per la loro temperatura ottimale di mantenimento. I tipi S crescono meglio a temperature che vanno dai 28° ai 35°, mentre gli L richiedono temperature di 18°#25°. Visto che la contaminazione tra le due specie avviene frequentemente, aumentare o abbassare la temperatura può essere una buona tecnica per ottenere colture pure: i rotiferi che si troveranno ad affrontare le temperature non ottimali per la loro riproduzione saranno presto soppiantati da quelle desiderate.
Significative differenze di taglia possono essere causate dal livello di salinità o dal regime alimentare. I rotiferi alimentari con lievito sono solitamente più grandi rispetto a quelli nutriti con alghe vive.
3.5. Condizioni generali di coltura
3.5.1. Rotiferi marini
3.5.1. Salinità
Nonostante i rotiferi Brachionus plicatilis possano sopportare un ampio range di salinità (da 1 a 97 ppt), solo acque aventi salinità inferiori di 35 ppt offrono le migliori condizioni per la riproduzione. Se i rotiferi saranno utilizzati per nutrire larve che richiedono una diversa salinità da quella usata per la coltura (± 5 ppt) è preferibile acclimatarli al livello dell'acqua in cui verranno trasferiti, poiché lo shock dovuto al brusco cambiamento di salinità, potrebbe inibire il nuoto o causarne la morte.
3.5.1.2. Temperatura
La scelta di una temperatura ottimale di coltura dipende dal morfotipo allevato; le specie L devono essere tenute a temperature più basse rispetto agli S. In generale, l'aumento delle temperature, negli specifici range ottimali, producono un'attività riproduttiva maggiore. Tuttavia il mantenimento di alte temperature fa aumentare i costi e inoltre rende necessaria una più frequente alimentazione. Ciò è essenziale per evitare periodi di sovra/sotto-alimentazione o di digiuno: ad alte temperature gli animali affamati consumeranno le loro riserve di lipidi e carboidrati molto velocemente, pertanto è preferibile versare in vasca poche quantità di cibo (per mantenere una buona qualità dell'acqua) con somministrazioni frequenti.
Al contrario, allevare rotiferi a temperature inferiori ai loro valori ottimali rallenta considerevolmente la loro crescita. La tabella 3.1. dimostra gli effetti della temperatura sulle dinamiche di popolamento dei rotiferi.
Tabella 3.1. Effetti della temperatura sull'attività riproduttiva dei Brachionus plicatilis
3.5.1.3 Ossigeno disciolto
I Rotiferi possono sopravvivere in acque che contengono meno di 2mg/l di ossigeno disciolto. Il livello di ossigeno nell'acqua della coltura dipende dalla temperatura, salinità, densità dei rotiferi e tipo di cibo dosato.
Onde evitare danni fisici ai rotiferi l'aerazione non deve essere troppo potente.
3.5.1.4. pH
I Rotiferi vivono a livelli di pH superiori a 6,6, tuttavia in acquacoltura i migliori risultati sono ottenuti con pH superiori a 7,5.
3.5.1.4. Ammonio (NH3)
Il rateo del NH3/NH4+ è influenzato dalla temperatura e dal pH dell'acqua. Alti livelli di ammonio non ionizzato sono tossici per i rotiferi, tuttavia sono tollerate concentrazioni di NH3 inferiori a 1mg/l.
3.5.1.6. Batteri
Pseudomonas e Acinetobacter sono comuni batteri opportunisti che costituiscono un'importante integrazione al cibo per rotiferi. Alcune specie di Pseudomonas, per esempio, sintetizzano la vitamina B12m che costituisce un fattore limitante per la coltura.
Sebbene alcuni batteri non siano patogeni per i rotiferi, la loro proliferazione andrebbe evitata per limitare i rischi di trasferire tali batteri alle larve che successivamente si ciberanno degli stessi rotiferi.
Una campagna di campionamento effettuata in vari allevamenti, ha dimostrato che la flora batterica dominante nelle colture di rotiferi è la Vibrio. Lo stesso studio ha dimostrato che la micro-flora presente nel cibo vivo è considerevolmente diversa tra i vari allevamenti; specialmente dopo gli arricchimenti, è stato trovato un alto numero di batteri associati. L'arricchimento delle colture, generalmente provoca un cambiamento nella composizione batterica: da una dominante di Cytophagal Flavobacterium si passa ad una dominante di Pseudomonasl Alcaligenes. Questo cambiamento è in parte dovuto alla fioritura dei batteri opportunisti ad alta crescita, favorita dagli alti livelli di substrato.
Il numero di batteri dopo l'arricchimento può essere riportato ai livelli iniziali con il controllo della densità dei rotiferi ed una conservazione appropriata (6°). il modo più efficace per ridurre i batteri, specialmente i Vibrionacei, consiste nel alimentare i rotiferi con il Lactobacillus plantarum. L'integrazione di questi batteri probiotici non ha solo un effetto regolante della micro-flora ma aumenta anche il rateo di crescita dei rotiferi.
Per stabilizzare la coltura di rotiferi, vanno considerate la loro condizione fisiologica e la micro-flora. Ad esempio, è stato dimostrato che la condizione dietetica dei rotiferi Brachionus plicatilis può essere misurata mediante il rendimento fisiologico e la reazione a determinate specie di batteri patogeni (Vibrio anguillarum TR27); la somministrazione di 10 6 - 107 unità/ml di V. anguillarum in una coltura di rotiferi alimentati in modo non ottimale, ne provoca l'affezione a tali batteri; mentre una coltura di rotiferi alimentati correttamente, non ne risente affatto.
3.5.1.7. Ciliati
I ciliati Halotricha e Hypotricha, come gli Uronema sp. e Euplotes sp., sono assolutamente indesiderati in una coltura di rotiferi, in quanto competono per il cibo. L'apparizione di questi ciliati è solitamente dovuta a condizioni di mantenimento non ottimali, provocano una ridotta attività dei rotiferi ed aumentano la possibilità che altri eventuali competitori possano debilitare la coltura. I ciliati producono scarti metabolici che aumentano il livello di NO2 nell'acqua e il relativo calo del pH. Tuttavia hanno un effetto positivo per l'eliminazione di batteri e detrito accumulati nella vasca.
Il dosaggio di una bassa concentrazione di formalina (20 ml/l) nella vasca di coltura algale, 24 ore prima dell'inoculo di rotiferi, riduce sensibilmente la possibilità di contaminazione da protozoi.
Selezionare e sciacquare i rotiferi usando filtri per fitoplancton (< 50 μm) serve a ridurre il numero di ciliati o altri piccoli contaminanti ed è un facile metodo di precauzione che andrebbe sempre effettuato per preparare una coltura "starter".
3.5.2. Rotiferi d'acqua dolce
I Brachionus calyciflorus e i Brachionus rubens sono i rotiferi comunemente allevati per l'acquacoltura d'acqua dolce. Tollerano temperature che vanno dai 15° ai 31°. Nel loro ambiente naturale prosperano in acque aventi diverse composizioni ioniche. I Brachiouns calyciflorus possono essere allevati in acque di coltura sintetiche costituite da 96 mg di NaHCO3, 60 mg di CaSO4.2H2O, 60 mg di MgSO4 e 4 mg di KCl in 1litro di acqua deionizzata. Il pH ottimale è di 6-8 a 25°, il livello minimo d'ossigeno è di 1,2 mg/l. Livelli di ammonio da 3 a 5 mg/l inibiscono la riproduzione.
I Brachionus calcyflorus e Brachionus rubens sono stati allevati con successo usando le micro-alghe Scenedesmus costato-granulatus, Kirchneriella contorta, Phacus pyrum Ankistrodesmus convoluus e Chlorella o diete a base di lievito o mangimi artificiali come il Culture Selco e il Roti-Rich. Il programma di alimentazione per i Brachionus rubens deve essere adattato al loro fabbisogno di nutrimento, leggermente maggiore rispetto ai B. plicatilis.
3.5.3. Procedure di colture
La produzione intensiva di rotiferi è solitamente eseguita con colture in serie in strutture al chiuso: queste sono più adatte rispetto a quelle all'aperto soprattutto se eseguite dove le condizioni climatiche non permettono la produzione all'aperto di micro-alghe. Sostanzialmente la strategia di produzione è la stessa sia per le strutture all'aperto che per quelle al chiuso, ma le più alte quantità di starter e densità di rotiferi raccolti permette l'uso di più piccole vasche di produzione (da 1 a 2 m3) in strutture al chiuso. In alcuni casi, il cibo algale può essere completamente sostituito da diete artificiali (vedi 3.5.3.6.).
3.5.3.1. Stoccaggio delle colture di rotiferi
Allevando grandi volumi di rotiferi con alghe, lievito o supplementi artificiali implica comunque il rischio di mortalità improvvisa delle colture. Le mancanze tecniche o umane, ma anche le contaminazioni di patogeni o filtratori competitori, sono le principali cause di una bassa riproduzione che può eventualmente provocare il crash completo della coltura. Contare solamente sul re-inoculo di rotiferi in nuove vasche è troppo rischioso. Per minimizzare i rischi, piccole quantità di rotiferi vengono spesso conservate in provette chiuse e tenute in camere isolate per prevenire la contaminazione di batteri e/o ciliati.
Queste colture stoccate, al fine di generare velocemente grandi quantità di nuovi rotiferi nel minor tempo possibile (in caso di emergenza), sono mantenute con micro-alghe.
I rotiferi destinati alla conservazione possono essere ottenuti dal ambiente naturale, istituti di ricerca o allevamenti commerciali. Tuttavia, prima di essere utilizzati in un ciclo di produzione, l'inoculo va disinfettato. La disinfezione più drastica consiste nell'uccisione di tutti i rotiferi ad eccezione delle uova, utilizzando un cocktail di antibiotici (10ml/l di eritromicina, 10ml/l di cloramfenicolo, 100 mg/l di penicillina e 20 mg/l di streptomicina) o un disinfettante. Le uova vengono poi separate dagli organismi morti utilizzando un filtro di 50 m e vengono incubate per l'allevamento; i rotiferi una volta nati, saranno usati come starter e per nuove coltura da conservare. Tuttavia se il liquido acquisito non dovesse contenere molte uova (come può accadere dopo lunghi viaggi), il rischio di perdere completamente la popolazione di rotiferi è troppo alto e la disinfestazione va effettuata con dosi non letali, l'acqua dei rotiferi viene poi completamente sostituita e i rotiferi trattati con antibiotici o disinfettanti. Il trattamento viene ripetuto dopo 24 ore al fine di assicurarsi che anche gli eventuali patogeni sopravvissuti al tratto intestinale dei rotiferi siano eliminati. La concentrazione dei prodotti disinfettanti varia a seconda della loro tossicità e dalle condizioni iniziali dei rotiferi.
Al laboratorio A&ARC le colture stoccate di rotiferi sono mantenute in stanze termo-climatizzate (28°C ± 1°). Le provette (contenitori conici per centrifuga da 50ml) sono preventivamente trattate con autoclave e disposte su un dispositivo rotante (4 rpm). Ad ogni rotazione l'acqua è mescolata con l'aria contenuta all'interno (± 8 ml), e fornisce sufficiente ossigeno ai rotiferi contenuti (Figura 3.4.). I contenitori sul rotore sono illuminati con due tubi fluorescenti alla distanza di 20 cm (intensità luminosa di 3'000 lux).
L'acqua di coltura (acqua di mare diluita con acqua fino a una salinità di 25 ppt) è aerata, pre-filtrata con un filtro a 1 m e disinfettata durante la notte con 5mg/l di NaOCl. Il giorno successivo, l'eccedenza di NaOCl viene neutralizzata con il Na2S2O3 e l'acqua viene filtrata a 0,45 m.
Figura 3.4.
L'inoculo dei rotiferi stoccati viene portato ad una densità iniziale di 2 rotiferi /ml. Il cibo fornito è costituito dalla Chlorella marina seguendo la procedura descritta in 2.3..
Le alghe sono centrifugate e concentrate ad una densità di 1-2,10 cellule /ml. Il concentrato algale è mantenuto a 4°C in un frigorifero per un periodo massimo di 7 giorni, che coincide con un ciclo di raccolta dei rotiferi. Ogni giorno il concentrato algale è omogeneizzato dallo scuotimento e ne vengono versati 200ml in ogni provetta. Se al posto del concentrato vengono somministrate alghe fresche, ne servono 4 ml.
Dopo una settimana la densità dei rotiferi dovrebbe essere aumentata da 2 a 200 ml /l (Figura 3,5). I rotiferi vengono quindi sciacquati, una piccola parte viene mantenuta per la conservazione, e la rimanente viene usata per la riproduzione ai fini dell'allevamento. Inoltre, dopo alcuni mesi di regolare conservazione, la coltura viene disinfettata nuovamente al fine di mantenere in salute la coltura stock e pulire i materiali di stoccaggio. Tuttavia il continuo mantenimento di colture di stoccaggio di Brachionus non elimina il rischio di contaminazioni batteriche.
Figura 3.5. Rateo di crescita della popolazione di rotiferi nelle colture di stoccaggio e durante la fase di riproduzione in contenitori erlenmeyer.
I trattamenti con antibiotici devono abbassare il carico batterico, ma nello stesso tempo insinuano il rischio di selezionare batteri resistenti agli antibiotici. Tuttavia, la disponibilità commerciale delle cisti costituisce una valida alternativa al mantenimento di colture di stoccaggio e alla riduzione delle possibilità di contaminazione da ciliati e batteri patogeni.
3.5.3.2. Selezione dei rotiferi per avviare nuove colture
La selezione dei rotiferi viene effettuata con specifiche tecniche che consistono nel: tenere dei recipienti erlenmeyer a 2 cm dai tubi fluorescenti (5'000 lux), la temperatura interna non deve superare i 30°, i rotiferi vengono conservati ad una densità di 50 individui /ml e alimentati con 400 ml di alghe appena raccolte (Chlorella), approssimativamente 50 ml di alghe vengono aggiunte ogni giorno per sopperire il fabbisogno giornaliero di cibo.
Dopo 3 giorni la concentrazione dei rotiferi dovrebbe aver raggiunto il livello di 200 unità /ml. Durante questo periodo di mantenimento non viene applicata nessuna aerazione.
Una volta che i rotiferi hanno raggiunto una densità di 200#300 individui / ml vengono lavati con dei filtri costituiti da due setacci. La prima rete (200 μm) trattiene le particelle di scarto, mentre la successiva (50 μm) trattiene i rotiferi.
I rotiferi concentrati saranno poi distribuiti in diversi boccioni da 15 litri (riempiti con 2 litri d'acqua e dotati di un tubo per aerazione) ad una densità di 50 individui / ml. Al fine di evitare contaminazioni di ciliati, l'aria dev'essere filtrata con del carbone attivo. Alghe fresche (Chlorella) vengono dosate quotidianamente. A giorni alterni le colture vengono pulite (filtrazione a doppia maglia) e conservate a densità di 200 rotiferi / ml. Dopo i vari dosaggi di alghe, per circa 7 giorni, i contenitori da 15 litri risulteranno riempiti completamente e le colture potranno essere usate per l'inoculo di colture di massa.
3.5.3.3. Produzione di massa con alghe
Senza dubbio, le micro-alghe marine costituiscono la migliore dieta per rotiferi e se un sufficiente numero di alghe sono disponibili e dosate con l'appropriato criterio, si possono raggiungere risultati eccezionali. Sfortunatamente, in molti casi non è possibile sopperire alla veloce capacità di filtrazione dei rotiferi che richiedono un elevato numero di alghe. Se l'infrastruttura e la manodopera lo permettono, può essere considerata una procedura quotidiana di raccolta e trasferimento delle alghe.
L'allevamento in serie è probabilmente il metodo più comunemente usato per la produzione di rotiferi negli allevamenti di pesci marini. La strategia consiste nel mantenimento di un volume costante di coltura con una crescente densità di rotiferi o il mantenimento di una densità costante con un crescente volume di coltura. Vengono applicate sia tecniche di coltura in larga scala (utilizzando grandi vasche da più di 50 m3), sia metodi intensivi (usando vasca da 200 a 2'000 litri). In entrambi i casi grandi quantità di micro-alghe, normalmente Nannochloropsis, sono inoculate nelle vasche assieme alle popolazioni d'avvio, contenenti da 50 a 150 rotiferi / ml.
3.5.3.4. Produzione di massa con alghe e lievito
A seconda della strategia e della qualità delle fioriture algali, può essere effettuata un'integrazione di lievito. La quantità di lieviti necessari all'alimentazione quotidiana dei rotiferi è circa di 1g/milione di rotiferi (questo valore possa variare a seconda del tipo di rotiferi (S, L) e delle condizioni della coltura). Se le alghe possiedono un alto volume nutrizionale, una buona galleggiabilità ed acqua incontaminata, possono essere usate il più possibile, non solo come cibo per rotiferi, ma anche per controllare la qualità dell'acqua e gli agenti batteriostatici.
Diversamente dai sistemi di allevamento europei, i giapponesi hanno sviluppato grandi sistemi di coltura di 10 - 200 tonnellate. La densità iniziale è relativamente alta (80-200 rotiferi /ml) e una grande quantità di rotiferi viene prodotta giornalmente con alghe ed integrazioni di lievito.
La produzione in larga scala di alghe e lievito è effettuata in sistemi di coltura in serie e semi-continui. Diverse varianti ad entrambi i metodi sono state applicate, e un esempio dei modelli di allevamento usati al The Oceanic Institute delle Hawaii è descritto qua:
- sistema di coltura in serie
Le vasche (1'200 l) sono riempite per metà con alghe ad una densità di 13-14 milioni di cellule/ml e inoculate con rotiferi ad una densità di 100 individui/ml. La salinità dell'acqua è di 23 ppt e la temperatura viene mantenuta a 30°. Il primo giorno viene somministrato del lievito attivo per due volte nell'arco della giornata, in una quantità di 0,25/ milione di rotiferi. Il giorno seguente le vasche vengono completamente riempite con alghe alla stessa densità e viene dosato 0,375 g/milione di rotiferi di lievito per due volte. Il giorno seguente i rotiferi vengono raccolti e nuove vasche vengono inoculate (sistema di coltura in serie di due giorni).
- Coltura semi-continua
In questa tecnica di coltura i rotiferi vengono tenuti nella stessa vasca per cinque giorni. Durante i primi due giorni il volume di coltura viene raddoppiato giornalmente per dimezzare la densità di rotiferi. Durante i giorni seguenti, metà del volume viene raccolto e riempito con acqua per dimezzare nuovamente la densità. Al quinto giorno l'intero contenuto della vasca viene raccolto e la procedura viene ricominciata da capo (sistema di coltura semi-continua da 5 giorni).
La composizione nutrizionale dei rotiferi alimentati con alghe non coincide automaticamente con il fabbisogno di molti dei pesci predatori e spesso implica la necessità di effettuare degli arricchimenti per migliorare i componenti nutrizionali dei rotiferi con acidi grassi, vitamine o proteine. Inoltre è stato dimostrato che l'integrazione della vitamina B12 è essenziale per la coltura dei rotiferi.
3.5.3.5. Coltura con lievito
Il lievito di birra è composto da piccole particelle (5-7 μm) e possiedono un alto contenuto proteico e ciò lo rende un alimento adatto ai Brachionus. I primi tentativi della completa sostituzione della dieta naturale dei rotiferi è stata caratterizzata da vari successi e da alcuni collassi repentini della coltura. Molto probabilmente, questi crash sono stati causati dalla scarsa digeribilità del lievito, che richiede la presenza di batteri per la digestione. Inoltre, il lievito necessita l'integrazione di acidi grassi essenziali e vitamine per soddisfare il fabbisogno degli organismi predatori. Gli integratori commerciali, come del resto le emulsioni fai-da-te (Oli di pesce emulgati con emulgatori commerciali o lecitina di tuorlo d'uovo), possono essere aggiunti al lievito o dosati direttamente nelle vasche dei rotiferi. I migliori successi sono stati ottenuti grazie ai rotiferi alimentati con lievito e omega 3 (rotiferi alimentati con un preparato di lievito prodotto aggiungendo olio di fegato di seppia al 15% del liquido di coltura). Successivamente le integrazioni al cibo per rotiferi o al loro liquido di coltura vengono effettuate con formulazioni di micro - particolati ed emulsionati.
Oltre al lievito di birra fresco, possono essere usati anche lieviti istantanei, lieviti marini (Candida) o lieviti Rhodotorula.
3.5.3.6. Coltura con alimenti artificiali
Il fertilizzante commerciale più usato nelle colture di rotiferi europee è il Culture Selco (CS) disponibile in forma secca. E' stato formulato come un sostitutivo completo delle alghe vive ed allo stesso tempo apporta alti livelli di EFA e vitamine ai rotiferi. La composizione biochimica del Culture Selco consiste in 45% di proteine, 30% di carboidrati, 15% di lipidi (di cui 33% sono omega 3 HUFA), e 7% di ceneri. Le sue caratteristiche fisiche sono ottimali per l'assimilazione da parte dei rotiferi: il particolato misura 7 μm, con una forte aerazione rimane perfettamente in sospensione nella colonna d'acqua e non si scioglie. Tuttavia, questo alimento deve essere messo in sospensione nell'acqua prima di essere somministrato, ciò facilità la possibilità di effettuare il dosaggio automaticamente, ma allo stesso tempo rende necessario un impianto per l'aerazione e per la conservazione al fresco. Le procedure standard di coltura che saranno presentante di seguito, sono state sviluppate e testate con diverse specie di rotiferi in vasche di 100 litri.
Si usano delle vasche coniche/cilindriche di 100 litri con pareti lisce e scure (polietilene) poste in un luogo ombreggiato. Il liquido di coltura è costituito da acqua di mare diluita ad una salinità di 25 ppt e portata ad una temperatura di 25°. Nessun cambio d'acqua verrà effettuato durante il periodo di coltura (4 giorni). Delle pietre porose saranno posizionate a pochi centimetri dal fondo conico della vasca per permettere la sedimentazione di eventuali particelle di scarto.
Il cibo flocculato sarà intrappolato da pezzi di lana che saranno immersi nella colonna d'acqua (Figura 3.6a.) o in filtri ad aria caricati con spugne (Figura 3.6b.).
(a)
(b)
Figura 3.6. Pezzi di lana (a) e filtro ad aria con spugna (b) per intrappolare il flocculato nella vasca dei rotiferi
Inoltre, tutte le operazioni sono eseguite per mantenere una buona qualità dell'acqua con accumuli minimi di cibo non assimilato; e ciò è possibile portando la densità iniziale di 200 rotiferi/ml e dosando piccole quantità di cibo ad intervalli regolari di un'ora; questo dosaggio temporizzato può essere effettuato pompando con una pompa peristaltica il prodotto conservato separatamente in contenitori refrigerati e leggermente aerati (Figura 3.7.) Applicando questo programma di alimentazione, il regime si può ottimizzare in funzione della densità e dalle condizioni della coltura (Tabella 3.2.). Va comunque detto che questo protocollo è indicato per le specie di rotiferi L mentre per i rotiferi S va leggermente adattato (con un dosaggio minore di cibo).
Figura 3.7. Del cibo mantenuto aerato e refrigerato viene distribuito ad intervalli regolari di tempo alle singole vasche di rotiferi con una pompa peristaltica temporizzata.
Adottando questa strategia si avrà un raddoppio della popolazione ogni due giorni, raggiungendo una densità di rotiferi al momento della raccolta di 600 unità/ml dopo solo quattro giorni (Tabella 3.3.); questo risultati sono sicuramente migliori rispetto quelli ottenuti con la tecnica tradizionale che prevede l'uso di alghe vive (e lievito di birra). Non ci sono inoltre grandi differenze nelle caratteristiche degli organismi e i collassi delle colture avvengono molto di rado, e ciò è forse dovuto al fatto che nessun contaminante microbico viene inserito nella coltura e la qualità dell'acqua si mantiene in buone condizioni per tutta la durata del ciclo d'allevamento. A questo riguardo, va prestata particolare attenzione alle precauzioni igieniche che permettono di evitare contaminazioni esterne: tutti i materiali utilizzati per la produzione vanno disinfettati con bagni in acqua e NaOCl, Hcl o altri disinfettanti. Dopo ogni ciclo di produzione (4 giorni) anche le vasche, le pietre porose e i tubi dell'aria vanno disinfettati. Per evitare collassi si raccomanda di effettuare mensilmente la disinfettazione di tutto il sistema e di avviare l'allevamento con nuove colture "starter".
Negli allevamenti commerciali, non sempre le pompe peristaltiche sono disponibili, ed in questi casi gli alimenti artificiali possono essere dosati in concentrazioni di 400-600 ml/milione di rotiferi, somministrate in 4-6 razioni.
Per limitare il numero di dosaggi di cibo manuali, può essere praticata una semplice tecnica basata sul gocciolamento. Viene posta in vasca un contenitore riempito di cibo concentrato e mantenuto areato; facendoci gocciolare dell'acqua la soluzione di cibo viene gradualmente diluita e si versa per tracimazione nella vasca dei rotiferi. La dimensione del contenitore dev'essere calcolata e costruita in modo tale che il suo contenuto si possa diluire completamente in 24 ore.
Figura 3.8. Illustrazione della tecnica di dosaggio per gocciolamento che può essere applicata senza l'ausilio di pompe sofisticate.
3.5.3.7. Allevamento in alta densità
Anche se l'alta densità di rotiferi aumenta il rischio di fornire maggiore stress alla coltura e di diminuire il rateo di crescita (a causa dell'innesco della riproduzione sessuale), sono stati ottenuti risultati davvero promettenti. La tecnica usata è la stessa adottata per le colture con il Selco con la differenza che dopo ogni ciclo di produzione (4 giorni), la densità dei rotiferi non viene riportata ai valori iniziali. Lo schema di alimentazione prevede 0,25-0,3 g / milione di rotiferi per colture aventi densità tra 500 e 1500 unità / ml e 0,2 g / milione di rotiferi per densità maggiori di 1500 unità / ml. Portare i rotiferi ad alte densità di stoccaggio provoca ripercussioni dirette sul rateo di deposizione delle uova; infatti si va da un 30% per densità di 150 unità /ml a 10 % per densità di 2000 unità /ml fino a meno del 5% per densità di 5000 rotiferi / ml. Mantenere colture con una così bassa quantità di uova è molto rischioso e pertanto questo sistema non viene usato per impianti ben controllati.
Le colture ad alta densità di Brachionus vengono spesso eseguite in Giappone. Con questa tecnica, vengono dosate alghe Nannochloropsis assieme a Chlorella d'acqua dolce, lievito di birra e lievito contenente olio di pesce. La Chlorella d'acqua dolce viene usata per integrare la vitamina B12.
In colture continue la popolazione di rotiferi raddoppia in 24 h. Metà della coltura viene rimossa giornalmente sostituendola con nuova acqua. Usando questo sistema si raggiungono densità di 1000 rotiferi / ml con dei picchi di più di 3000 animali per ml d'acqua.
3.5.4. Raccolta/concentrazione dei rotiferi
La raccolta di rotiferi in impianti di piccola-scala, solitamente viene effettuata sifonando il contenuto delle vasche di coltura e filtrandolo con reti di 50#70 μm. Se questa operazione non viene effettuata con filtri sommersi, i rotiferi possono danneggiarsi e morire. Pertanto è raccomandato raccogliere i rotiferi sotto l'acqua: a questo scopo le sciacquatrici c concentratori sono ottimi (Figura 3.10.). L'aerazione durante il processo di concentrazione dei rotiferi non nuoce agli animali, ma non deve essere eccessivamente potente.
Figura 3.10. Vista dall'alto e di lato di un concentratore contenente un filtro a rete da 50 μm ed equipaggiato con un collare d'aerazione sul fondo.
3.6. Valori nutrizionali dei rotiferi allevati
3.6.1. Tecniche d'arricchimento per (omega3) HUFA
3.6.1.1. Alghe
L'alto contenuto di acidi grassi essenziali EPA e DHA di alcune micro-alghe (ad esempio Nannochloropsis occulata e Isochrysis galbana), le rende delle eccellenti risorse di cibo vivo, adatte ad incrementare gli acidi grassi essenziali dei rotiferi. I rotiferi, immersi in queste alghe, assimilano gli acidi grassi in poche ore. Tuttavia, l'uso delle microalghe come unica dieta per i rotiferi implica un'intensiva manodopera a causa della produzione algale. Il più delle volte i rotiferi vengono arricchiti con emulsioni di olio e successivamente dati in pasto ai predatori mantenuti in "acqua verde". Quest'acqua verde consiste in ± 2'000'000 di cellule algali / ml (Tetraselmis, nannochloropsis o Isochrysis) che contribuisce a mantenere un valore appropriato di HUFA delle prede vive, prima che queste vengano mangiate dai predatori.
3.6.1.2. Nutrimenti artificiali
I rotiferi cresciuti con il Culture Selco hanno già una composizione HUFA eccellente: 5,4 (EPA), 4,4 (DHA) e 15,6 (omega3) mg / g a secco. Sono valori significativamente alti rispetto ai rotiferi cresciti con una dieta a base di alghe e lievito ma non tanto dissimili da organismi alimentati con alghe e lievito e soggetti ad integrazione di HUFA. Dato che l'uso del CS permette un arricchimento diretto dei rotiferi senza la necessità di effettuare scomodi trattamenti di bio-incapsulazione, sono stati sviluppati dei nutrimenti complementari come il Protein Selco (PS) e il DHA Culture Selco (DHA - CS): prodotti specifici per incrementare rispettivamente i livelli di proteine e di DHA. Il vantaggio di arricchimenti diretti (e a lungo termine) sono molteplici: il profilo di acidi grassi ottenuto è stabile e riproducibile, il contenuto di lipidi è simile a quello dello zooplancton selvatico, le perdite di rotiferi è minore e i costi di manodopera vengono sensibilmente ridotti.
Tuttavia alcune larve di pesci marini hanno un fabbisogno ancora maggiore di HUFA, pertanto ulteriori arricchimenti sono comunque necessari.
3.6.1.3. Emulsioni d'olio
Uno dei metodi più economici per arricchire i rotiferi è l'arricchimento con emulsioni d'olio. Le emulsioni fai-da-te possono essere preparate con lecitina di uova e olio di pesce. Tuttavia le emulsioni disponibili sul commercio sono generalmente più stabili e contengono una selezionata composizione di HUFA.
- emulsioni fai-da-te
La prima emulsione fu preparata con oli di pesce ricchi di (omega3)HUFA (olio di seppia, olio di fegato di pollack, olio di fegato di merluzzo, olio di menadi, ecc.), tuorli d'uovo emulsionati ed acqua di mare. Recentemente vengono usati degli oli più puri e contenenti più alti e specifici livelli di acidi grassi essenziali. Visto che la stabilità e la possibilità di stoccaggio di questi prodotti sono piuttosto relative, sono solitamente preparati al momento ed usati immediatamente.
Per applicazioni più specifiche, o quando il fabbisogno dei pesci non può essere soddisfatto da emulsioni commerciali, questa tecnica può essere adottata per incorporare estratti di lipidi da zooplancton, pesci o altre fonti. Le figure 3.13. e 3.14. rappresentano una comparazione tra due preparati commerciali (Super Selco e DHA Super Selco) e due arricchitori emulsionati fai-da-te.
- emulsioni commerciali
Diversi prodotti emulsionati sono disponibili in commercio e sono basati su formulazioni ben precise. Un concentrato auto emulsionante (Selco) riesce ad aumentare il contenuto di HUFA dei rotiferi in poche ore. Questo metodo prevede di immergere per 6 ore una coltura (con densità di 200#300 unita/ml) in un’emulsione d'olio diluita, quindi raccolta, sciacquata e concentrata prima di essere data in pasto ai predatori.
Data l'importanza del DHA nella larvi-coltura marina, sono stati fatti molti sforzi per incorporare alti livelli di DHA e/o alti rapporti di DHA/EPA nei rotiferi. I migliori risultati sono stati ottenuti usando il prodotto auto-emulsionante DHA-Super Selco. Comparando i risultati ottenuti integrando con il Super Selco i rotiferi allevati con Culture Selco, si nota che i valori di DHA e omega3 HUFA totali sono tre volte superiori.
Inoltre, è stata studiata l'evoluzione della concentrazione di EFA nei rotiferi arricchiti nella vasca dei predatori. I risultati rivelano che i livelli di EFA rimangono piuttosto costanti per almeno 7 ore (a 20°), mentre dopo 12 ore avviene un aumento di solo 30% dei valori di DHA.
Molti preparati commerciali sono ricchi di trigliceridi e/o metilestere mentre nessuno è stato formulato con fosfolipidi ed estere di cera. Nella figura 3.13. le emulsioni commerciali comunemente usate, vengono comparate alle emulsioni fai-da-te ottenute da estratti di copepodi e uova di halibut. Anche se il contenuto di DHA e EPA ottenuto con quest'ultime è inferiore, la concentrazione relativa dei acidi grassi totali è molto più alta.
E' interessante notare che dopo l'arricchimento, le variazioni di omega3 HUFA ottenute, non superano il 30-45%. Inoltre la composizione di lipidi dei rotiferi dipende dalla composizione dei nutrimenti utilizzati. Pertanto, analizzando l'efficienza delle integrazioni di DHA e omega 3 HUFA, si evince che i risultati migliori si ottengono utilizzando prodotti di estrazione. Siccome tutti i nutrienti vengono consumati simultaneamente si può affermare che i fosfolipidi (presenti nei prodotti derivati da estrazioni) sono i composti che vengono assimilati e metabolizzati con più facilità.
Tabella 3.5. Concentrazione di acidi grassi (mg/g) nei rotiferi arricchiti
3.6.2. Tecniche di arricchimento della vitamina C
Il contenuto di vitamina C dei rotiferi dipende dai livelli di acido ascorbico (AA) contenuti dagli arricchitori. Per esempio, i rotiferi allevati con lieviti istantanei contengono 150 mg /g di vitamina C, mentre quelli alimentati con Chlorella ne contengono 2300 mg /g.
L'arricchimento dei rotiferi con acido ascorbico avviene usando il palmitato di ascorbile (AP) come fonte principale di vitamina C. L'AP viene convertito dai rotiferi in acido ascorbico attivo raggiungendo livelli di 1700 mg /g (attuando procedure di arricchimento di 24 ore in emulsioni contenti 5% di AP). Lo stoccaggio di rotiferi in acqua salata dopo la coltura o l'arricchimento non ha effetti sul contenuto di AA durante le prime 24 ore, perciò significa che quando vengono usati per alimentare le larve in un allevamento ben avviato, mantengono il loro valore nutrizionale.
Tabella 3.6.Contenuto di Acido ascorbico (mg/g) dei rotiferi allevati in laboratorio e in allevamenti commerciali
3.6.3. Arricchimento di proteine
Per quanto ne sabbiamo il Protein Selco è l'unico integratore formulato appositamente per l'arricchimento di proteine dei rotiferi. I suoi alti livelli di proteine permette alla coltura di crescere e svilupparsi anche durante la procedura di arricchimento. Normalmente è usato allo stesso modo di un'emulsione d'olio (miscelato con un frullatore da cucina) e versato in vasca (ad una concentrazione di 125 ml/l d'acqua) in due somministrazioni ad intervalli di 3 - 4 ore.
La tabella 3.7. illustra una comparazione tra i livelli di proteine contenuti da rotiferi arricchiti con tre diverse tecniche d'arricchimento (A: arricchimento a lungo termine in coltura con lievito + 10% di Super Selco; B: breve arricchimento con DHA-Selco; C: breve arricchimento con Protein Selco). Il peso a secco dei rotiferi è molto alto con il Protein Selco ma simile alla soluzione A e B. I livelli proteici sono più alti con C rispetto a B ma identici tra A e C. I livelli di lipidi sono molto più alti con la tecnica C rispetto alla A, ma non ci sono differenze tra C e B. I rotiferi arricchiti con tecnica A hanno il rapporto proteine/lipidi più alto mentre, con il B il più basso.
3.6.4. Raccolta, concentrazione e stoccaggio a freddo dei rotiferi
Come è stato spiegato precedentemente, la raccolta e la concentrazione dei rotiferi non arricchiti, può essere effettuata mediante filtri sommersi. La raccolta dei rotiferi arricchiti va eseguita con estrema attenzione al fine di evitare formazioni di agglomerati, e specialmente quando gli organismi arricchiti sono stati concentrati (prima del risciacquo) l'aerazione può provocare tali ammassi. Quindi invece di versare energeticamente i rotiferi arricchiti in un secchio di raccolta, si consiglia di sifonarli dal liquido proprio per evitare l'interferenza delle bolle d'aria.
I rotiferi che non potranno essere utilizzati immediatamente (per il nutrimento delle larve) vanno conservati a bassa temperatura al fine di preservare la loro qualità nutrizionale. I rotiferi se mantenuti senza alimentazione per un giorno a 25° possono perdere fino al 26% del loro peso corporeo a causa della loro attività metabolica. Ad esempio, se dei rotiferi ben arricchiti (con emulsioni d'olio, micro - particolati o micro-alghe) rimangono a digiuno immediatamente prima di essere dati in pasto ai predatori, il loro contenuto di acidi grassi sarà sensibilmente diminuito, tanto che gli animali cominceranno a sentirsi sazi solo dopo 20 o 30 minuti! Dopo circa 6 ore trascorse nelle vasche delle larve, gli HUFA dei rotiferi possono essere calati di 1/3 rispetto ai livelli originali. L'arricchimento dei tessuti, che va eseguito durante la coltura dei rotiferi, permette una diminuzione degli acidi grassi più lenta e costante, ed è il metodo più efficiente per preservare gli HUFA e permetterne un calo meno repentino.
3.7. Produzione ed uso delle cisti
Il metodo più usato per l'allevamento di massa di rotiferi destinati al nutrimento di larve è la riproduzione amittica. Tuttavia se si desidera produrre uova al fine di creare dei prodotti conservabili e pronti all'uso vanno seguite determinate procedure.
Le uova, dette anche cisti, sono relativamente grandi (il loro volume è circa il 60% di un organismo femminile adulto), sono ideali per lo stoccaggio e il trasporto e possono essere usate come inoculi per avviare nuove colture. L'allevamento di rotiferi basato sulla produzione di uova è effettuata con colture in serie e può essere raccolto dal sedimento accumulato nel fondo vasche di cemento o dei laghetti di terra. La formazione delle cisti può essere indotta limitando l'apporto di cibo o cambiando la salinità e/o temperatura. Le cisti, per loro natura, affondano e vanno raccolte dal fondo. Quando eccessive quantità di rifiuti si accumulano sul fondo, si consiglia di sostituire l'acqua salata con acqua salmastra cosicché le cisti possano galleggiare ed essere raccolte dalla superficie. Le cisti a secco possono essere conservate per più di un anno e quando saranno riposte nuovamente in acqua salata per 24 ore a 25° in una vasca illuminata, si schiuderanno e i nuovi rotiferi potranno essere allevati con riproduzione asessuale.
Figura 3.17. Vista al microscopio di due cisti comparate a due femmine amittiche.
Usare cisti di rotiferi per avviare nuove colture apporta molteplici vantaggi: l'uso di colture stock riduce drasticamente i costi di manodopera e della produzione di alghe.
Inoltre l'uso delle cisti previene le contaminazioni; infatti possono essere trattate prima della schiusa eliminando batteri e ciliati attraverso procedure di disinfettazione con alte dosi di antibiotici (resistono a brevi esposizioni ai disinfettanti come NaOCl o glutaraldeidi).
Modalità lineare
